Ústav biochemie

Biochemie denitrifikačních bakterií

Hlavní řešitelé

  • Igor Kučera,
  • Pavel Bouchal
  • Vojtěch Sedláček

Popis projektu

Denitrifikace je anaerobní respirační pochod uskutečňovaný mikroorganismy, které jsou schopny místo kyslíku využívat jako alternativní akceptory elektronů kyslíkaté sloučeniny dusíku. Při denitrifikaci jsou oxoanionty dusičnan a dusitan přeměňovány na didusík a v menší míře na oxid dusný, jenž působí jako účinný skleníkový plyn a narušuje ochrannou ozonovou vrstvu. My pracujeme s bakterií Paracoccus denitrificans jako s modelovým denitrifikujícím organismem. Tato bakterie normálně obývá ekosystémy jako půda, voda a čistírenské kaly. Aerobně rostoucí buňky mají respirační řetězec, blízce připomínající respirační řetězec mitochondrií přítomností respiračních komplexů I – IV a homologu ubichinonu s deseti izoprenovými zbytky v postranním řetězci (UQ-10). Protože není schopna fermentovat, bakterie získává za anaerobiózy energii denitrifikací. K tomuto účelu vytváří čtyři enzymy (nitrátreduktasu, nitritreduktasu a reduktasy oxidu dusnatého a dusného), které katalyzují postupnou redukci běžně přítomného dusičnanu až na plynný didusík.

Naše výzkumná skupina se snaží porozumět molekulovým mechanismům některých zajímavých oxidačně-redukčních reakcí, jejich metabolické úloze a ovlivnění po vystavení buněk různým vnějším faktorům. Používáme širokou škálu postupů od nástrojů molekulární biologie (klonování a sekvence genů, kazetová a místně cílená mutageneze, fuze promotorů s reportérovým genem, kvantitativní RT-PCR), přes biochemické metody (izolace proteinů, měření aktivity) a stanovení krystalové struktury až po studie s celými buňkami divokého a mutantních kmenů.

Popis inovace nebo popis hlavních úspěchů projektu

  • Distribuce toku elektronů v rozvětveném respiračním řetězci. Systém přenosu elektronů v cytoplazmatické membráně P. denitrificans končí u tří rozdílných oxidas uskutečňujících redukci kyslíku na vodu a u čtyř denitrifikačních enzymů katalyzujících následné reakce dusičnan -> dusitan -> oxid dusnatý -> oxid dusný -> didusík. Rádi bychom přispěli k objasnění složitého vzájemného působení mezi těmito enzymy, které dáno kompeticí o společné donory elektronů a inhibičním působením oxidu dusnatého. Jednou z cest je použití specifických mutantů.
  • Význam rychlosti transportu dusičnanu do buněk. Dusičnan musí projít přes cytoplazmatickou membránu dříve, než interaguje s prvním enzymem denitrifikační dráhy. Tento přesun je zprostředkován specifickým přenašečem nitrátu a je často považován za krok limitující rychlost celého denitrifikačního pochodu. Tuto možností se v současnosti zabýváme s použitím kmenů vytvářejících výlučně membránově vázanou nitrátreduktasu orientovanou do cytoplazmy (Nar) nebo periplazmatický enzym (Nap) a inhibitorů nitrátového přenašeče.
  • Flavin-dependentní oxidoreduktasy FerA a FerB. P. denitrificans má dva rozpustné enzymy, FerA a FerB, jež jsou schopny redukovat množství komplexů trojmocného železa s využitím NADH. Oba proteiny interagují s flaviny, ale odlišným způsobem. FerA nezbytně vyžaduje flavin jako kosubstrát a může být proto klasifikován jako NADH:flavin oxidoreduktasa. Naproti tomu FerB obsahuje nekovalentně vázaný flavinový koenzym, který přenáší elektrony z NAD(P)H na různé akceptory jako chinony, komplexy Fe(III) nebo chroman. Nedávno se nám podařilo klonovat a exprimovat gen ferB, krystalizovat selenomethioninový derivát proteinu a určit jeho krystalovou strukturu. Získaná strukturní data umožní studie vztahů mezi strukturou a reaktivitou. Zvláštní úsilí bude věnováno objasnění úlohy FerA a FerB v buněčném metabolismu.
  • Odezva bakteriálního proteomu na změny růstových podmínek. V současnosti využíváme 2D elektroforézy a denzitometrie ke srovnání hladin proteinů v různých kmenech rostoucích za aerobních, semianaerobních a anaerobních podmínek. Jako součást tohoto výzkumu budeme rovněž sledovat vliv látek vyvolávajících oxidační stres s cílem detektovat a identifikovat zúčastněné proteiny a geny.

Seznam nejvýznamějších publikací

Financování

Mechanismy regulace respiračních systémů denitrifikačních bakterií faktory prostředí. GACR 203/01/1589

Struktura, funkce a regulace FerB, širokospecifické bakteriální oxidoreduktasy s možným významem pro ekotechnologii. GACR 525/07/1069


login
© 2011 Přírodovědecká fakulta Masarykovy univerzity. tel: +420 549 49 1111, e-mail:
Všechna práva vyhrazena.
Webmaster: Alan Kuběna,
Grafický design: © 2011 Mgr. Pavel Brabec,
Obsahová struktura: © 2011 Mgr. Zuzana Kobíková
Počet přístupů: 8072 od 7.12.2011