Extrakce a spektrofotometrické stanovení fotosyntetických pigmentů

Trocha teorie:

Téměř všechny živé organismy na Zemi (s výjimkou např. chemolithotrofních bakterií) využívají ve svých metabolických procesech chemickou energii, která byla původně přeměněna z energie světelného záření fotoautotrofními organismy, např. sinicemi, řasami nebo zelenými rostlinami, v procesu fotosyntézy. Z hlediska života na Zemi jsou tedy fotosyntetické pigmenty a mezi nimi zvláště chlorofyly jednou z klíčových molekul.

Fotosyntetické pigmenty se u zelených řas a rostlin vyskytují v tylakoidních membránách chloroplastů ve formě pigment-proteinových komplexů - fotosystémů. Rozlišují se dvě skupiny barviv: zelené chlorofyly a žluto-oranžovo-červené karotenoidy. Jejich obsah a složení je důležitým ukazatelem stavu fotosyntetického aparátu, závisí na druhu rostliny, stáří asimilačních orgánů, minerální výživě a také podmínkách růstu (rozdíl mezi stinnými a slunnými listy).

Molekuly chlorofylů jsou složeny ze dvou komponent: substituovaný porfyrinový kruh s centrálně navázaným kationtem Mg2+ a dlouhý uhlovodíkový řetězec - fytol. Chlorofyly se v přírodě vyskytují v několika formách, přičemž u zelených rostlin nalezneme dvě: chlorofyl a (nejdůležitější pro fotosyntézu) a chlorofyl b.   Chlorofyl b se od chlorofylu a liší pouze substitucí metylové skupiny za skupinu aldehydovou na 3. atomu uhlíku. Tyto dvě formy chlorofylů se v přírodě vyskytují obvykle v poměru 3:1 (chl a:chl b). Jejich modro-zelená až zelená barva je dána jejich absorpčním spektrem, kdy molekuly chlorofylů zachycují především modrou a červenou složku světla a jeví se proto jako zelené. Z chemických vlastností, ačkoli porfyrin má hydrofilní charakter, nepolární charakter fytolu je pro molekuly chlorofylů významnější a ty jsou proto dobře rozpustné v nepolárních rozpouštědlech (ethanol, aceton, benzen...).

Karotenoidy se rozlišují do dvou skupin - karoteny (známý např. β-karoten) a xantofyly. Ve srovnání s chlorofyly je obsah karotenoidů obvykle nižší, v poměru přibližně 5:1 (chl a+b: karotenoidy). Z hlediska funkce se karotenoidy označují jako tzv. doprovodné pigmenty. Účastní se procesu zachycování světla, kde díky odlišnému absorpčnímu spektru zachycují fotony jiných vlnových délek než chlorofyly. Mají však také ochrannou funkci, protože vnitřní přeměnou své molekuly při nadbytku zachycené světelné energie jsou schopné tuto energii přeměnit na teplo a ochránit tak ostatní součásti fotosystémů před destrukcí přebytečnou excitační energií. Často je uváděna také jejich anti-oxidační funkce. Z chemického hlediska jsou, podobně jako chlorofyly, hydrofóbní a jsou proto rozpustné v tucích a nepolárních rozpouštědlech.

Chlorofyl a

* CH3
C55H72MgN4O5, relativní molekulová hmotnost 893,49
maximální absorpce: λ=430 nm a λ=662 nm
Chlorofyl b

* CHO
C55H70MgN4O6, relativní molekulová hmotnost 906,51
maximální absorpce: λ=453 nm a λ=642 nm

 

Pomůcky a potřeby:

Čerstvé listy kukuřice (Zea mays), třenka, pipety 2, 5 a 10 ml, odměrné baňky (25 nebo 50 ml), skleněná tyčinka, filtrační papír, filtrační nálevky, stojan s filtračními kruhy, laboratorní váhy, spektrofotometr, mořský písek, 100% aceton, MgCO3.

Postup:

  1. Odvážíme přibližně 0,25 nebo 0,5 g čerstvých listů, zapíšeme si přesnou hmotnost a změříme jejich listovou plochu
    (pro kukuřici, pokud měřená část listu není obdélníková, platí vzorec: délka (mm)ךířka (mm)×0,00758 = LA (cm2)).
  2. Listy rozstříháme do třenky na menší kousky a přidáme malé množství mořského písku a uhličitanu hořečnatého.
  3. Obsah třenky důkladně rozetřeme a poté promyjeme 5 ml acetonu. Necháme chvíli ustát a poté extrakt přes skleněnou tyčinku filtrujeme přes filtrační papír předem zvlhčený acetonem do odměrné baňky (25 nebo 50ml).
  4. Bod č. 2 opakujeme několikrát za sebou, až do úplného odbarvení obsahu třenky.
  5. Acetonem promyjeme rovněž filtrační papír - kvantitativně přeneseme do roztoku veškerý chlorofyl.
  6. Acetonový extrakt chlorofylu v odměrné baňce doplníme po značku.
  7. Oproti blanku (aceton) změříme pomocí spektrofotometru absorbanci vzorku při λ=663 nm, λ=646 nm a λ=470 nm.
  8. Pro větší přesnost stanovení je vhodné měření každého vzorku 2-3krát zopakovat a změřit také absorbanci při λ=750 nm, pomocí které zjistíme případný zákal vzorku a jejíž hodnota se od ostatních hodnot absorbancí odečte.
  9. Koncentraci fotosyntetických pigmentů v extraktu vypočteme dle následujících rovnic (Wellburn A.R. (1994)  J. Plant Physiol. 144: 307-313):
     
    C(chl a) =   12,21×A663 - 2,81×A646     [mg.l-1]
    C(chl b) = 20,13×A646 - 5,03×A663     [mg.l-1]
    C(c+x) = (1000×A470 - 3,27×C(chl a) - 104×C(chl b))/198     [mg.l-1]
     
    kde A jsou absorbance při příslušné vlnové délce a šířce kyvety 1 cm.
     
  10. Výsledky přepočteme na množství pigmentů na jednotku hmotnosti (1 g) a jednotku plochy (1 cm2) čerstvých listů.

 

Prezentace a diskuze získaných dat

  1. Jak se liší obsah chlorofylů a karotenoidů u vámi testovaných rostlin kukuřice?
  2. Jaký je poměr chlorofylu a: chlorofylu b a odpovídá tento poměr teoreticky udávané hodnotě?