Vodní potenciál je veličinou, kterou v rostlinné fyziologii používáme k popisu a kvantifikaci transportu vody v rostlinách. Osmotický potenciál je jednou z jeho složek. V rámci praktických cvičení využijete ke stanovení vodního a osmotického potenciálu tři metody:
Kromě těchto ve cvičeních použitých metod existují i další metody stanovení osmotického potenciálu rostlinných pletiv, např. metoda kryoskopická.
Rostlinný materiál:
česnek cibule (Allium cepa) - epidermis dužnatých suknic cibule, odrůda obsahující v epidermis
anthokyany;
douška hustolistá (Egeria densa) - lístky ze submerzních
stonků.
Vlastní provedení:
Ze zásobního 1 M roztoku sacharózy připravíme do malých kádinek (objem cca 20-30
ml) koncentrační řadu 0 až 0,8 M sacharózy, odstupňované po 0,1
M. Zásobní roztok sacharózy má oproti vodě poměrně vysokou hustotu
(objemovou hmotnost), je nutné dbát na dobré promísení obou složek.
Do těchto inkubačních roztoků umístíme kousky neporušené epidermis cibule a lístky doušky. Po dobu inkubace (nejméně 30 minut) musíme zabezpečit dokonalý kontakt s osmotikem (inkubačním roztokem) a vzorky během této doby musíme občas promíchat, abychom zabránili vzniku koncentračních gradientů v blízkosti rostlinného pletiva. Pro docílení výsledků s co nejmenší variabilitou je vhodné použít co nejhomogennější rostlinný materiál: alespoň přibližně stejně staré lístky doušky nebo epidermis z jedné vrstvy suknice cibule.
Poté namontujeme takto inkubovaný rostlinný materiál jako mikroskopický preparát. Jako uzavírací médium musíme použít příslušné inkubační médium! Takto získané preparáty pozorujeme mikroskopickou technikou světlého pole a odhadneme (případně přesně stanovíme) podíl buněk, které jsou působením osmoticky aktivního inkubačního roztoku alespoň minimálně plazmolyzovány. Výsledky vyneseme pro každý druh jednotlivě graficky (tvar závislosti dávka-odpověď) a z grafu odečteme koncentraci osmotika, kdy by u jednotlivých druhů došlo k plazmolýze 50 % počtu buněk v jejich pletivech (hraniční plazmolýza).
Získané hodnoty koncentrace osmotika pro hraniční plazmolýzu dosadíme do van't Hoffovy rovnice pro výpočet osmotického potenciálu:
π = -R T c i [kPa]
kde
R...univerzální plynová konstanta (8,31447 kPa mol-1 K-1);
vyjádření R v jiných jednotkách naleznete např. na
této webové stránce
T...absolutní teplota, za níž experiment provádíme (T = 273,15 + t [°C])
c...koncentrace sacharózy, při níž nastává hraniční plazmolýza
i...koeficient zohledňující disociaci osmotika, pro sacharózu roven 1
Úkoly:
Rostlinný materiál:
lilek brambor (Solanum tuberosum) - zásobní hlízy.
Vlastní provedení:
Do zkumavek připravíme dvě sady inkubačních roztoků, pokrývajících obdobně jako
v předchozím případě škálu 0,1 až 0,8 M sacharózy. Do jedné z těchto sad
umístíme korkovrtem získané segmenty parenchymu zásobních hlíz brambor a necháme je inkubovat
po dobu 30 minut. Musíme zabránit odpařování vody po dobu inkubace!
Po této době změříme pomocí refraktometru koncentraci sacharózy jak v inkubační,
tak v kontrolní sadě zkumavek. Výsledky vyneseme graficky (refraktometricky naměřené
hodnoty oproti výchozí koncentraci sacharózy) a koncentraci, při níž nastává
hraniční plazmolýza, odečteme v místě průniku přímky zjištěné pro kontrolní
sadu zkumavek s křivkou zjištěnou pro sadu s inkubovanými pletivy lilku bramboru. Tuto
hodnotu opět dosadíme do van't Hoffovy rovnice.
Úkoly:
Rostlinný materiál:
pelargonie páskatá (Pelargonium zonale) - listy muškátu.
Princip metody:
Při stanovení vodního potenciálu listu tlakovou metodou působíme na list stlačeným
plynem, nejčastěji dusíkem. Vodní potenciál pletiva je roven záporné
hodnotě tlaku, při jehož působení se začne voda pohybovat z pletiva ven.
Tento tlak je indikován xylémovou šťávou, která se objeví ve formě kapky
na řezné ploše řapíku listu (tzv. rovnovážný tlak - "balancing pressure").
Cílem této úlohy je porovnat hodnoty vodního potenciálu rostlin plně zalitých oproti
rostlinám rostoucím v suchém substrátu, popřípadě listů po určitou dobu
odstřižených od rostliny.
Vlastní provedení:
List odřízněte z rostliny žiletkou vždy tak, aby řezná plocha na řapíku
byla šikmá pod úhlem přibližně 45 stupňů. List upevněte do gumové zátky
(obr. 1) a opatrně vsuňte do tlakové komory (obr. 2, A) tak, abyste nepoškodili řapík
listu, a víko tlakové komory pevně zašroubujte. Celou tuto operaci je nutné
provést velice rychle, cca do 20 vteřin. V opačném případě je nutné
zamezit transpiraci listu při jeho montáži pomocí polyethylenové (potravinářské)
fólie, která se sejme těsně před vlastní montáží víka tlakové
komory(A). Zkontrolujte připojení přívodu stlačeného plynu
(B) a otočením ventilu (C) do polohy "Fill chamber" začněte zvyšovat tlak v komoře. Rychlost nárůstu tlaku můžete regulovat v závislosti na typu vzorku nastavením jehlového ventilu
označeného "Flow rate" (D). Pomocí lupy nebo preparačního mikroskopu
pozorujte pozorně řeznou plochu řapíku vystupujícího z víka komory. V okamžiku, kdy celá řezná plocha zvlhne,
popřípadě kdy začne řeznou plochou "probublávat" vzduch, zastavte přívod vzduchu do komory otočením ventilu
(C) do polohy "Off" a na tlakoměru (E) odečtěte z pozice červeného
ukazatele dosažený tlak v komoře. Tato hodnota (v barech) je číselně rovna
vodnímu potenciálu (který je ovšem záporný). Převeďte získanou hodnotu
tlaku na hodnotu vodního potenciálu listu (MPa).
Tlak v komoře po měření vypusťte nastavením ventilu (C) do polohy "Vent
chamber)". Po poklesu tlaku na nulu odšroubujte víko tlakové komory (A)
a změřený vzorek vyjměte. Červený ukazatel nejvyššího dosaženého tlaku
na tlakoměru (E) pomocí nástavce nastavte na nulu. Po namontování nového
vzorku můžete pokračovat v měření vodního potenciálu dalšího vzorku.
Upozornění: v průběhu celého měření je bezpodmínečně nutné chránit
si zrak speciálními brýlemi!
Úkoly:
Potřebujete znát vztah mezi tlakem a výškou vodního sloupce? Přečtěte si str. 4 a 10 ve skriptech!