Jiří Pacherník

Klíčová slova

myokard, kmenové buňky, kardiomyogeneze, specifikace kardiomyocytů

Vedoucí skupiny:
Mgr. Jiří Pacherník, Ph.D.
Kancelář: UKB – A36/111
E-mail: jipa@sci.muni.cz
Telefon: 549 49 5578
Seznam vyučovaných předmětů
Seznam publikací

 

Zaměření LSCP:

Kmenové buňky představují specializovanou skupinu buněk, které jsou schopné sebeobnovy a zároveň dávat vznik i dalším buněčným typům. Jako takové se podílejí na růstu a regulaci homeostáze organismu v průběhu celého jeho vývoje. Pochopení mechanismů jejich vzniku a zachování v organismu je nedílnou součástí pochopení základních principů jak normálního tak patologického vývoje mnohobuněčných organismů.

V naší práci jako modelový organismus používáme laboratorní myš (Mus musculus domesticus), z ní odvozené buněčné linie a současně také některé vhodné linie lidských buněk. Základní studie jsou prováděny s embryonálními kmenovými a z nich odvozenými buňkami, zejména kardiomyocyty.

Dospělý myokard, dle současných znalostí, kmenové buňky neobsahuje a jeho regenerační schopnosti jsou tak velice omezené. Pří poškození myokardu je tak řešením buď transplantace srdce nebo transplantace kardiomyocytů, připravených in vitro z pluripotentních buněk, či jiných buněk, reprogramovaných do kardiomyocytů. Ideálním zdrojem by byly kmenové buňky myokardu, za jejichž vzor můžeme považovat některé kardiomyogenní progenitory přechodně existující během embryonálního vývoje. V případě kardiomyocytů připravených v in vitro podmínkách je však třeba i zohlednit, jaké typy kardiomyocytů byly vytvořeny.

V našem výzkumu se teda především zabýváme jak připravit kmenové buňky myokardu a jak připravit požadovaný typ kardiomyocytu a snažime se přispět k odpovědi na tyto otázky:

Jak vybrané faktory nasměrují diferenciaci
Kardiomyogeneze z pluripotentních buněk přes buňky mezodermu se neděje spontánně, ale pod vlivem mnoha faktorů, struktur a chemických látek, kterým jsou buňky vystaveny a které také samy produkují. Poznatky jaké faktory to jsou a jak ovlivňují vlastní kardiomyogenezi vedou k zvýšení efektivity a tak i výtěžnosti kardiomyogeneze in vitro. Co se týče struktur, naše pozornost je zaměřená především na sledování změn v charakteristikách a vývoji buněk při pěstování na rozdílných polymerech. Dále se snažíme pěstovat selektované kardiomyocyty spolu s dalšími buňkami vyskytujícími se v srdci (fibroblasty) ve 3D strukturách a sledujeme jejich morfologické a funkční změny. Pokud jde o chemické látky, studujeme vliv celé řady chemických inhibitorů a aktivátorů rozdílných signálních drah a jejich efekt na diferenciaci buněk do rozdílných typů kardiomyocytů.
Flux vápnikových iontů v kardiomyocytech
Jak připravit kmenové buňky myokardu
Myokard se vyvíjí z mezodermu. První specifikované buňky, ze kterých vzniká většina buněčných struktur srdce, včetně vlastních kardiomyocytů jsou buňky kardiomyogeního mezodermu. Tyto buňky jsou velice nezralé a intenzivně se dělí. Pokud by se tyto buňky podařilo převést do in vitro kultury, při zachování jejich vlastností, mohly by představovat kmenové buňky myokardu. K tomuto kroku je však potřeba poznat, jaké mechanismy jsou odpovědné za jejich regulaci. Proto na kmenové buňky a buňky v časných fázích diferenciace působíme různými faktory a snažíme se odhalit mechanismus jejích působení a jejich potenciál k využití na získání buněk kardiomyogeního mezodermu.
Jak vylepšit rozlišování jednotlivých buněčných subtypů a stádií při diferenciaci
Variabilita mezi jednotlivými typy kardiomyocytů je dána požadavky na jejich funkci v příslušné oblasti myokardu. Tato specifikace se promítá do jejich expresního profilu a následně i do jejich fyziologických vlastností. V dospělém srdci jsou tak jednotlivé typy kardiomyocytů vcelku jasně definovány svou prostorovou pozicí, specifickou morfologií, expresním profilem, charakterem průběhu akčního potenciálu, či dynamikou toku vápenatých iontů. In vitro kultivace a příprava kardiomyocytů z kmenových buněk působí na buňky nestandardně, a tak znaky jasně definované pro kardiomyocyty dospělého myokardu tu zde neposkytují jednoznačnou informaci o jejich fenotypu. Navíc změny těchto znaků a jejich vývoj jsou také součástí změn, které buňky podstupují během své diferenciace a zrání, ať už reálně in vivo v organizmu, nebo v in vitro kulturách. K co nejpřesnějšímu určení fenotypu námi získaných buněk se proto snažíme využít co nejvíce metod (qPCR, westernblotting, patchclamp, hmotnostní spektrometrie) a tyto následně pro naše účely optimalizujeme a pomocí dalších molekulárních postupů zvyšujeme jejich citlivost (použití CRISPR-Cas, porovnávaní in vitro kultur s embryonálními a dospělými vzorky srdce atd.).
Jak vybrané signální dráhy ovlivňují diferenciaci
Signální dráha, na kterou se nejvíce zaměřujeme, je signální dráha MAPK.
Protein kinázy aktivované mitogeny (MAPK) jsou rodina proteinů, součást dráhy, která se účastní buněčné odpovědi na růstové faktory, hormony, stres atd. MAPK signální dráha také sehrává úlohu v diferenciaci do rozdílných buněčných linií. Změny v signální jejich aktivitě jsme pozorovali jak v hypoxii, tak i vlivem různých chemických látek. Pozorovali jsme také spojitost mezi signální aktivitou a změnami v buněčné diferenciaci. MAPK jsou enzymaticky aktivní v případě, že mají fosforylované konkrétní serin/treoninové a tyrozinové zbytky. Inaktivované jsou defosforylací, kterou vykonávají fosfatázy z rodiny duálně specifických fosfatáz (DUSP). DUSP specificky inaktivují jen MAPK. Role členů DUSP rodiny v MAPK dráze je momentálně v popředí našeho zájmu, zejména pak vliv na diferenciaci do srdečních a neurálních buněk.
Aplikace
Naše poznatky a dovednosti aplikujeme i v biotechnologickém výzkumu. Námi připravené buňky jsou využívání k testování biokompatibility i fyzikálních vlastností zejména vodivých syntetických polymerů. Cílem je vyvinout vhodné arteficiální struktury pro kultivaci buněk a vytváření nových tkání a orgánů pro transplantace. Dalším cílem, je příprava analytických sond, které by umožnili sledovat chemické změny v tkáních in vivo.

Spolupráce

  • Doc. Ing. Petr Humpolíček, Ph.D. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně, Fakulta technologická a Centrum polymerních materiálů
  • Doc. Mgr. Petr Vaňhara, Ph.D. Masarykova univerzita, Lékařská fakulta

Současní studenti (a jejich práce – viz IS PřF MU):

Absolventi:

Seznam grantově podpořených projektů
• GA19-16861S 01.01.2019 – 31.12.2021 Interakce biomateriálů s kmenovými buňkami v simulovaných in vivo podmínkách, spoluřešitel: J. Pacherník
• GA18-18235S 01.01.2018 – 31.12.2020 Nové možnosti v kardiomyogenní diferenciaci pluripotentních kmenových buněk, rešitel: J. Pacherník
• GA17-05466S 01.01.2017 – 31.12.2019 Role kanonické signální dráhy Wnt v neurogenezi, spoluřešitel: J. Pacherník
• GJ15-13443Y 01.01.2015-31.12.2017 Úloha hypoxií indukovaného faktoru 1 alfa ve vývoji populace neurálních kmenových buněk myši, řešitel: J. Večeřa

Studentské projekty:
• Příprava ventrikulárního kardiomyocytu z pluripotentních kmenových buněk (E. Kohoutková)
• MUNI/C/1392/2017 01.02.2018 Interakce hypoxie a signální dráhy Wnt v neurogenezi (L. Woloszczuková)
• MUNI/C/0836/2011 01.01.2012 Exprese a aktivita ABC transportérů odpovědných za MDR u mES buněk (M. Kohutková Lánová)