Zpět na úvodní stránku / Back to homepage
Metoda stanovení aktivity Hillovy reakce umožňuje studium fotochemických procesů na úrovni tylakoidní membrány chloroplastů. Pozornost se zaměřuje zejména na změny v pigmentoproteinových komplexech při absorpci a přenosu záření a toku elektronů z fotosystému II (PSII) k fotosystému I (PSI). Aktivita Hillovy reakce může být využita pro posouzení vlivu nejrůznějších sloučenin (těžké kovy, herbicidy), ale i vnějších faktorů (teplota, ozářenost atd.) na rostliny.
Princip metody
Intaktní chloroplasty vyizolované z fotosyntetických pletiv jsou schopné ve vhodných podmínkách po omezenou dobu být fotosynteticky aktivní. Při stimulaci světlem tak probíhají všechny primární fotochemické reakce, včetně fotolýzy vody (Hillova reakce). Elektrony vzniklé v tomto procesu však přijímá umělý akceptor, např. 2,6-dichloro-indophenol (DCIP), který tak přechází do redukovaného stavu a mění se tím jeho optické vlastnosti. Tuto změnu lze zaznamenat pomocí spektrofotometru.
Postup
Pro experiment se stanovením aktivity Hillovy reakce byl jako pokusná rostlina zvolen hrách setý (Pisum sativum L.) a sledována byla změna aktivity izolovaných chloroplastů buď přímo vystavených roztoku fluoranthenu (FLT) nebo získaných z listů rostliny pěstované (18 a 25 dní) v přítomnosti FLT. Pro izolaci chloroplastů byl vybrán vhodný, plně vyvinutý a fotosynteticky aktivní list. Po 18 dnech kultivace byl zvolen třetí a čtvrtý list, po 25 dnech pátý a šestý list. Pro maximální výtěžnost intaktních chloroplastů byla optimalizována metodika izolace chloroplastů, zejména chemické složení a koncentrace jednotlivých složek izolačního a resuspendačního média a následně i poměr hmotnosti listů ku objemu izolačního média.
Optimalizace metodiky izolace chloroplastů
Celý postup izolace chloroplastů probíhá při teplotě 0 - 4°C. Všechny používané roztoky se připravují den předem a úprava na požadované pH (pH = 7) se provádí v den izolace.
Vlastní postup (viz též graficky v PDF):
Vlastní stanovení aktivity Hillovy reakce
Konkrétní množství a poměry chemikálií v redoxním systému, vhodný objem suspenze chloroplastů, expoziční čas a metoda přepočtu absorbance na procenta redukce umělého akceptoru elektronů závisí jak na rostlinném druhu, tak i na typu umělého akceptoru elektronů a použitých chemikáliích.
Další informace je možno získat z odborného článku publikovaného v časopisu Chemosphere
pod názvem "Evaluation of fluoranthene phytotoxicity in pea plants by Hill reaction and chlorophyll fluorescence" (Kummerová, M., Krulová, J., Zezulka, Š., Tříska, J. (2006), Chemosphere 65(3): 489-496).