Příprava vzorků rostlinné biomasy pro analýzy

Analýza rostlinného materiálu je důležitou součástí většiny experimentů ve fyziologii rostlin, neboť umožňuje poměrně přesně dokumentovat změny, ke kterým v pokusném materiálu dochází při působení experimentálních faktorů. Před začátkem analýz je třeba jasně definovat, co budeme stanovovat. Nabízejí se dvě možnosti:

  1. Potřebujeme znát prvkové složení materiálu (tedy množství různých prvků v jednotce biomasy)
  2. Chceme zjistit obsah jednoho nebo celé skupiny metabolitů v biomase.

Stanovení prvkového složení

Pokud nám postačuje informace o množství uhlíku, dusíku a vodíku, je možno využít CHN analyzátor pracující na principu plynové chromatografie. Jako vzorek slouží jemně pomletá sušina, která se při analýze spaluje a vzniklé plyny jsou analyzovány. 

Pokud potřebujeme znát kompletní prvkové složení, je nutné před analýzou biomasu rostlin úplně zmineralizovat,  tedy převést na čistě anorganické látky. Mineralizaci můžeme provést dvojím způsobem: 
a) Suchou cestou – spalováním v kelímcích v peci nebo na kahanu – starší metoda, relativně rychlá s vysokou produktivitou připravených vzorků avšak, část prvků může unikat ve formě plynných oxidů a analýza je potom nepřesná.
b) Mokrou cestou – mineralizace probíhá v roztoku, v přítomnosti silné kyseliny (kyselina sírová nebo dusičná), oxidačního činidla (peroxid vodíku) katalyzátorů oxidace (zejména selenu) a salycilové kyseliny (redukce nitrátů na amonné ionty). Pro zvýšení bodu varu se navíc přidává CuSO4 nebo Na2SO4. Směs je zahřívána buď v Kjeldahlově baňce na topném hnízdě nebo pomocí zdroje mikrovln (speciální mikrovlnné spalovně) v uzavřené teflonové nádobce. 

Stanovení koncentrace jednotlivých prvků v mineralizátu můžeme provádět různými analytickými metodami. Ke starším patří klasické reakce analytické chemie založení na titračním nebo spektofotometrickém stanovení. K moderním analytickým postupům patří potom absorbční nebo emisní atomová spektometrie nebo ICP založená na sledování pohybu ionizovaných atomů v magnetickém poli.

Stanovení složek metabolismu nebo jiných molekul a iontů přítomných v buňkách

1. Pomletou nebo rozdrcenou biomasu extrahujeme vhodným činidlem (nejlépe specificky rozpouštějícím stanovovanou látku).
2. Extrakt analyzujeme vhodnou metodou (např. spektofotometrimetricky, pomocí HPLC atd.)

Mletí sušiny rostlin

Sušinu vždy jednoho orgánu a varianty vysypeme na arch filtračního papíru a pomocí nůžek rozstříháme na 0,5 – 1 cm dlouhé kousky, všechnu ji pomeleme a nasypeme zpět do popsaného papírového sáčku. Pro vlastní pomletí sušiny může použít některý z dostupných mlýnků:
Rotační břitový mlýnek – výsledný produkt je středně hrubý, postačuje pro účely mineralizace mokrou cestou. Relativně rychlé mletí.
Vibrační kuličkový mlýnek – pro jemné mletí sušiny určené pro extrakce a CHN analýzu. Mele menší množství a mletí trvá delší dobu. 

Mineralizace rostlinné biomasy mokrou cestou spalováním na topných hnízdech v Kjeldahlových baňkách

  1. Navážíme 0,25 g rozemleté sušiny každého orgánu rostlin ve všech pokusných variantách (např. 4 varianty × 3 orgány = 12 vzorků).
  2. Navážku opatrně nasypeme do spalovací baňky pomocí speciální násypky, aby sušina neulpívala na stěnách baňky.
  3. Přidáme 2–3 skleněné kuličky pro zamezení utajeného varu, peletku komerčně dostupného selenového katalytického činidla (Merck No. 8030), 5 ml směsi kyseliny sírové se salicylovou kyselinou, promícháme.
  4. Kjeldahlovy baňky uzavřeme Al fólií a necháme 2 až 16 hodin při pokojové teplotě.
  5. Baňky umístíme na topná hnízda přednastavená na 200 °C, zapneme digestoř a zahříváme asi 60 minut.
  6. Poté zvýšíme teplotu na 340 °C.
  7. Baňky odstavíme do stojanu a necháme mírně zchladnout. Potom do nich v digestoři přidáme 1ml koncentrovaného peroxidu vodíku. Pozor, směs prudce reaguje ! Peroxid přikapáváme pomalu a ústí baňky směřuje směrem do digestoře ! Pokračujeme ve spalování. 
  8. Bod 7 opakujeme, dokud není roztok v baňce čirý a světlý.
  9. Po ochlazení přidáme do baňky 20 ml destilované vody. Pozor, baňka se silně zahřívá ! 
  10. Zředěný mineralizát přefiltrujeme opatrně přes papírový filtr do odměrné baňky 50 ml a doplníme po značku destilovanou vodou.
  11. Mineralizát přelijeme do popsané polyethylenové lahvičky.

    LABORATORNÍ PLÁŠTĚ NUTNÉ !!!