Kultivační experiment - založení

1. Typy kultivace rostlin - teorie

Rostlinná fyziologie je oborem, který získává poznatky mimo jiné na základě experimentů, v nichž jsou rostliny jakožto pokusné objekty kultivovány za více či méně definovaných podmínek. Z hlediska kultivace rostlin mají klíčovou roli tyto dva faktory:

• klimatické podmínky: teplota, relativní vzdušná vlhkost (RH, angl. relative humidity) a ozářenost rostlin včetně spektrálního složení světla. Důležitá je i periodicita těchto podmínek, simulující jejich přirozený denní rytmus a při dlouhodobější kultivaci rovněž změny způsobené střídáním ročních období. Z hlediska regulace klimatických podmínek můžeme experimenty rozdělit do následujících kategorií:
  
  • kultivace v růstových komorách - fytotronech: teplota a RH jsou regulovány pomocí technických prostředků, rovněž zdroj zářivé energie pro fotosyntézu je umělý (zářivky, sodíkové nebo metalhalidové výbojky, LED). Fytotrony umožňují nastavit časový denní režim ozářenosti rostlin, a to buď ve stavech zapnuto/vypnuto, anebo s plynulými změnami intenzity ozářenosti, popř. i se změnami spektrálního složení světla, a rovněž požadovaný denní průběh teploty a RH. V tomto typu kultivace máme klimatické podmínky pod největší kontrolou a lze je nejsnáze popsat (typicky ve tvaru např. 16/8 hodin režim světlo/tma, intenzita fotosynteticky aktivní radiace 250 µmol (PAR) m^-2 s^-1, teploty 22/18 (± 2) °C, relativní vzdušná vlhkost 70/85 (± 10) %). Výhodou je, že toto zjednodušení klimatických poměrů umožňuje docílit vyšší reprodukovatelnost výsledků. Tento systém většinou musíme použít, pokud vlastním experimentálním faktorem jsou právě klimatické podmínky, tedy chceme-li např. studovat vliv teploty či ozářenosti na růst rostlin nebo tvorbu jejích zásobních látek.
    
  • kultivace ve sklenících: umožňuje opět technickými prostředky ovlivňovat teplotu a RH, ovšem obvykle méně přesně než je tomu u fytotronů. Výhodou je, že jako zdroj zářivé energie je alespoň částečně využíváno přirozené sluneční záření, s možností dosvětlovat pomocí výbojek či LED světel. Popis klimatického režimu může být komplikovanější, ovšem skleníková kultivace má nezastupitelné místo v rozsáhlejších experimentech, kdy může být omezená plocha fytotronu nedostatečná.
    
  • venkovní kultivace: u tohoto typu máme pouze velmi omezené možnosti regulovat teplotu nebo RH, intenzitu fotosynteticky aktivní radiace můžeme snižovat stíněním (pozor na doprovodný jev snížení teplot!). Tento typ kultivace je nejhůře popsatelný z hlediska klimatických pěstebních podmínek, které musíme v tomto případě kontinuálně zaznamenávat a vhodným způsobem vyhodnotit. Rostlinám však poskytuje nejpřirozenější podmínky obdobné těm, ve kterých rostou v přírodě (platí samozřejmě pouze pro druhy pro danou oblast nativní či pěstované a pro experiment prováděný ve vhodném ročním období). Venkovní kultivace proto má nezastupitelnou roli u experimentů, v nichž nás zajímá chování rostlin v podmínkách pro rostliny co nejpřirozenějších, tedy zejména v ekofyziologických studiích nebo při studiu růstu zemědělských plodin v reálných venkovních podmínkách. 

    

• pěstební médium či substrát: poskytuje rostlinám prostor pro růst kořenů, zásobuje je vodou a minerálními živinami, případně se v něm mohou vyskytovat pro rostliny symbiotické mikroorganismy, ať již mutualistické, nebo parazitické (patogenní). Opět rozlišujeme několik typů kultivace:
  
  • vodní kultury rostlin a hydroponie: jako médium pro růst kořenů a zdroj vody a minerálních živin slouží živný roztok. Existuje velké množství různých předpisů živných roztoků, lišících se zejména obsahy jednotlivých živin. Vodní kultury lze rozdělit do několika podtypů. U promíchávaných kultur je zabezpečeno, že se nebudou tvořit difúzní gradienty kolem kořenů. U okysličovaných kultur je do média zaveden proud vzduchu, který současně živný roztok promíchává. Používá se zejména u rostlin, jejichž kořeny jsou citlivé na hypoxii až anoxii.
    V průběhu kultivace se postupně mění vlastnosti živného roztoku (obsah živin, pH). Stacionární kultury, v nichž roztok není vyměňován, lze proto použít pouze pro krátkodobé kultivace. U dlouhodobějších kultivací je nutná výměna živného roztoku, která může probíhat buď periodicky, nebo kontinuálně (průtoková kultura).
    Výhodou vodních kultur je snadná definovatelnost a příprava živného média. Jejich nevýhodou je naopak fakt, že aplikace poznatků v nich získaných na reálné ekologické nebo polní podmínky je silně limitovaná, neboť vodní kultury se v řadě charakteristik od půdního prostředí velmi výrazně liší. Zcela zásadní význam při výživových studiích má absence adsorpční kapacity, která je vlastní půdě. Typicky se při nich jejich použití nevyskytují symbiotické asociace s mikroorganismy, zejména mykorhizní symbiózy nebo symbiózy s fixátory N₂, které však mohou velmi výrazně ovlivňovat příjmem živin a růst rostlin. Jejich zahrnutí do vodních kultur je možné, použije-li se aeroponická kultura (kořeny rostlin jsou smáčeny aerosolem živného roztoku).
  • "agarové" kultury: při nich je živný roztok ztužen pomocí agaru, fytagelu či jiné látky, který vytváří želatinovou konzistenci. Používají se zejména při in vitro kultivacích, v tkáňových a meristémových kulturách.
  • pískové kultury, případně kultury využívající jako náhradu SiO₂ písku jakožto pěstebního substrátu jiné více či méně inertní materiály typu perlitu, zeolitů či minerálních vat typu "Rockwool". I v tomto případě se jedná o variantu hydroponické kultivace, neboť veškeré živiny, které se v tomto pěstebním systému vyskytují, jsou dodány formou živného roztoku. Oproti předchozím mají výhodu, že se kořeny nacházejí v prostředí s přirozenějšími fyzikálními vlastnostmi. Možná je i inokulace rostlin symbiotickými mikroorganismy.
  • půdní kultury využívají jako pěstební médium zeminu, pokud možno z přirozeného stanoviště dané rostliny, popřípadě jiný substrát. Ty mohou být před vlastní kultivací částečně upravena, např. sterilizací (teplem, chemickými fumiganty nebo gama zářením) či ředěním inertním materiálem, např. křemenným pískem. Možný je buď přirozený, nebo cílený výskyt symbiotických organismů. Obdobně jako u klimatických podmínek venkovní kultivace tento typ kultur poskytuje výsledky, které jsou nejsnáze aplikovatelné na konkrétní ekologické podmínky, v nichž zkoumaný druh roste v přírodě nebo v agroekosystému. Problémem může být špatná definovatelnost použité půdy nebo zeminy a tím i obtížná reprodukovatelnost výsledků.

2. Vlastní založení experimentu:
    "Vliv úplné deficience vybraných živin na růst kukuřice seté (Zea mays L.)"

Cíl experimentu:
Cílem experimentu je zjistit, jak ovlivňuje úplná deficience některých živin (N, P, Fe, popřípadě Ca) růst a morfologické charakteristiky kukuřice seté (Zea mays L.) pěstované v periodicky obměňované vodní kultuře

Rostlinný materiál a ostatní potřeby:
Zea mays - v destilované vodě hydroponicky předpěstované, cca 5 dní staré rostliny;
Pěstební nádoby, upevňovací materiál (např. PE granule nebo mirelonová zátka);
Zásobní roztoky Reid-Yorkova živného roztoku (Reid & York 1958, doi:10.2134/agronj1958.00021962005000020002x).

Vlastní provedení:
Nejprve si připravíte pěstební nádoby s jednotlivými variantami kultivačního Reid-Yorkova živného roztoku. Živný roztok (např. v požadovaném objemu 5 litrů) připravíte tak, že do 4 litrů destilované či demineralizované vody postupně přidáváte jednotlivé zásobní roztoky solí (množství viz tabulka níže), přičemž mezi přídavkem jednotlivých roztoků celý objem promícháváte. Poté doplníte destilovanou vodou do objemu 5 litrů.

Rostliny kukuřice upevníte do kultivačních nádob s příslušným živným roztokem. Rostliny umístíte do klimatizovaného skleníku, v němž bude kultivace probíhat po dobu několika týdnů. Hodnoty nastavení klimatizace skleníku vám sdělí vedoucí cvičení. Až do doby ukončení experimentu budou pravidelně v týdenních intervalech vyměňovány živné roztoky za nové, čerstvě připravené.

Design experimentu:
Pro tento experiment realizovaný ve skleníku je vhodný plně znáhodněný experiment, umožňující následně vyhodnotit data jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA, angl. one-way ANalysis Of VAriance). Tento design, vyžadující randomizaci (znáhodnění) přiřazení jednotlivých sázených rostlin do experimentálních variant a posléze i randomizaci umístění jednotlivých rostlin na pěstební ploše ve skleníku, umožňuje splnit dva základní předpoklady ANOVy, a sice nezávislost jednotlivých opakování uvnitř experimentálních variant a nezávislost chyb (chyba ve statistickém významu je náhodná veličina, zahrnující zejména genetickou konstituci a aktuální stav studovaného biologického objektu, ale zahrnuje rovněž např. možné chyby experimentátora, např. při míchání roztoků). Pro randomizaci je možné, kromě jednoduchého losování papírku z klobouku, využít např. funkci RANDBETWEEN v software MS Excel.

Jako alternativu plně znáhodněného uspořádání pokusu je možné využít design plně znáhodněných bloků, eliminující případné nehomogenní podmínky ve skleníku; tento design je tím výhodnější, čím heterogennější podmínky na pěstební ploše skutečně jsou (např. pokud je na pěstební ploše výrazný světelný gradient). V rámci tohoto designu jsou nejprve na celkové pěstební ploše vytyčeny menší, co nejhomogennější plochy, přičemž na tyto menší dílčí plochy jsou následně pozičně náhodně umísťovány náhodně vybrané rostliny jednotlivých variant tak, aby na každé takové menší dílčí ploše byla každá experimentální varianta zastoupena právě jednou (dvěma, třemi...) rostlinami.

POZOR!!! Z důvodů snadné manipulovatelnosti, zejména při pravidelných týdenních výměnách roztoků, je možné, že budete rostliny jednotlivých experimentálních variant sázet nikoli do samostatných nádob (ve kterých by tyto rostliny byly, pokud by byly na pěstební ploše umístěny v takové vzdálenosti od sebe, aby si vzájemně nestínily, navzájem nezávislé), ale do jedné společné kultivační vany (kde budou rostliny samozřejmě obecně navzájem závislé; např. čím více rostliny dané varianty porostou, tím více si budou vzájemně stínit; pokud některá z rostlin poroste z důvodu své genetické konstituce rychleji než ostatní, bude odčerpávat více živin a tím méně jich zbyde pro ostatní rostliny; pokud některá z rostlin v pěstební vaně bude infikována nějakým patogenním organismem, rapidně se zvyšuje pravděpodobnost napadení i zbylých rostlin ve vaně a tedy v celé variantě...). V reálné vědecké praxi není možné tímto způsobem žádný experiment realizovat!!!

Tabulka přípravy živného Reid-Yorkova roztoku ze zásobních koncentrovaných roztoků. Množství v ml na 1L roztoku

Složení Reid-Yorkova živného roztoku (1958). Obsahy sloučenin v 1 litru živného roztoku

3. Úkoly ke cvičení

1. Dle výše uvedeného předpisu Reid-Yorkova živného roztoku vypočtěte molární koncentrace N-NH₄ a N-NO₃, P a K v plné, kontrolní variantě! (Potřebujete-li, zde je periodická tabulka prvků a kalkulačka.)
2. Zásobní roztoky makroelementů (200× koncentrované) jsou připraveny tak, že každý roztok soli je v samostatné lahvi. Jaký je k tomu důvod?
3. Popište detailně souvislým textem (rozsah zhruba 10 řádků) kultivační podmínky, za kterých provádíte kultivační experiment (analogie kapitoly Materiál a metody v diplomové práci nebo vědeckém článku)!