Stanovení transpirace rostlin

Transpirace je hlavním mechanismem výdeje vody rostlinou. Z hlediska životní strategie rostlin se jedná o proces, který do značné míry souvisí s nutností přijímat CO2 z atmosféry do intercelulárních prostor fotoasimilačních pletiv. Jelikož voda je velmi často limitujícím faktorem růstu rostlin, ty si v průběhu evoluce musely vyvinout účinné mechanismy optimalizace toku těchto látek. Jedná se zejména o řízenou regulaci otevřenosti/uzavřenosti průduchů, související jak s procesy fotosyntézy, tak s aktuálním stavem nasycenosti rostliny vodou.

Z hlediska cesty, kterou je voda z rostliny transpirována, rozlišujeme transpiraci stomatární (výdej vody štěrbinami průduchů) a kutikulární (výdej přes epidermis a kutikulu). Za podmínek dostatečného osvětlení rostlin (neplatí pro CAM rostliny) a jejich dostatečné saturace vodou intenzita stomatární transpirace obvykle několikanásobně převyšuje intenzitu kutikulární transpirace. Podíl kutikulární transpirace bývá vyšší u mladých listů a u listů rostlin pěstovaných ve stínu.

V rámci cvičení budete stanovovat:

  1. rychlost transpirace rostlin přímým měřením pomocí potometrů (spolu s ověřením fotoaktivní regulace otevřenosti průduchů);
  2. rychlost transpirace gravimetricky na intaktních rostlinách a na odříznutých listech (Ivanovova metoda);
  3. počet průduchů na jednotku listové plochy.

1. Potometrické stanovení rychlosti transpirace

Princip:
Listy rostlin za normálních podmínek (tedy pokud např. nesnižují svůj vodní systostní deficit) přijímají vodu transportovanou xylémem stejnou rychlostí jako je rychlost vypařování (transpirace) z listu do prostředí. Měřením rychlosti příjmu roztoku řapíky listů sledované rostliny tedy můžeme odhadnout, jakou rychlostí probíhá její transpirace. Rychlost příjmu vody můžeme sledovat jako změnu objemu v kalibrované pipetě, ke které je odříznutý list po dobu měření připojen pomocí silikonové hadičky. Celý měřící systém se nazývá potometr (viz. obr. 1).

Obr. 1: 1 Potometr pro odříznuté listy. (1) kalibrovaná pipeta, (2) ventil se stříkačkou pro doplňování vody, (3) kohout, (4) měřený list.

Pomůcky a rostlinný materiál:
Čtyři potometry, injekční stříkačky 5 a 20 ml, malý ventilátor, černá tkanina, rostliny pelargónie páskaté (Pelargonim zonale)

Vlastní provedení:
Potometr naplníme pomocí stříkačky vodou filtrovanou přes membránový filtr s póry o velikosti 0,45 µm.
Řapík listu ještě před odříznutím omotáme kouskem parafilmu. List odřízneme a rychle připojíme k hadičce potometru tak, aby v hadičce nebyly žádné vzduchové bubliny. Spojení mezi listem a hadičkou utěsníme další vrstvou parafilmu.
Vytlačením malého množství roztoku ze stříkačky nastavíme meniskus roztoku v pipetě do pravé části stupnice. Po chvíli ustálení se meniskus začne pohybovat směrem k listu v důsledku zmenšování objemu roztoku v systému. Rychlost pohybu menisku zaznamenáme jako posun o určitý počet dílků na stupnici za 2 minuty. Odečet provádíme celkem šestkrát a zjištěné rychlosti pohybu přepočítáme podle kalibrace stupnice pipety na rychlost úbytku roztoku v jednotkách objemu. Transpiraci vyjádříme jako rychlost příjmu vody listem vztaženou na plochu listu. Listovou plochu stanovíme na planimetru po skončení měření. Výslednou rychlost transpirace pro danou rostlinu vypočteme podle vztahu:

vt= (ΔV × ρ) / (A × Δt )


vt – rychlost transpirace [g m-2 h-1]
ΔV – změna objemu vody v pipetě [ml]
ρ – hustota vody [g ml-1]
A – plocha listové čepele [m2]
Δt – časový interval, ve kterém sledujeme úbytek objemu vody v pipetě [h]

Poznámky:
 - abychom standardizovali podmínky výparu pro všechny měřené rostliny, necháme kolem rostlin v průběhu měření proudit konstantní rychlostí vzduch (větráček);
 - měříme změny objemu kapaliny a objem kapaliny závisí na teplotě prostředí. Je proto důležité aby při měření byla teplota v místnosti stabilní;
 - pokud se meniskus v kapiláře nepohybuje, zkontrolujte těsnost upevnění rostliny a pokud ani to nepomůže, vyměňte list za jiný.

Vlastní experiment: Vliv fotosynteticky aktivního záření na rychlost transpirace

Postup:
Měříme rychlost transpirace za normálních podmínek 12 minut. Potom rostlinu co nejvíce zastíníme pomocí černé tkaniny na laboratorním stojanu. Tkanina přitom nesmí ležet přímo na listech rostliny a měl by pod ni stále proudit vzduch z větráku. V průběhu zastiňování a dalších 16 minut po zastínění stále odečítáme rychlost transpirace.

Úkoly:
1. Po skončení měření vypočtěte rychlost transpirace rostliny v jednotlivých časových intervalech a hodnoty vyneste do grafu v závislosti na čase. Na časové ose označte místo, kdy byla rostlina zastíněna.
2. Vypočtěte průměrnou rychlost transpirace rostliny před a po zatemnění.
3. Vypočtěte, o kolik procent se změnila rychlost transpirace po zatemnění ve srovnání s rychlostí před zatemněním.
4. Pokuste se vysvětlit základní příčiny pozorovaných změn v rychlosti transpirace.

2. Stanovení rychlosti transpirace gravimetricky

Princip:
Jedná se o metodu, kdy vážíme buď intaktní rostliny, nebo pouze odstřižené listy (Ivanovova metoda). V případě Ivanovovy metody se vychází z faktu, že v prvních minutách po odstřižení transpirují listy normálním způsobem, tak jako na celistvé rostlině. Teprve po delší době (zhruba desítky minut; silně druhově a ekologicky specifické) dochází k uzavírání průduchů a rostliny dále transpirují pouze přes kutikulu (kutikulární transpirace).
U některých rostlin se krátce po odstřižení může vyskytnout přechodné zvýšení intenzity transpirace. Tento jev nazýváme Ivanovovým skokem.

Rostlinný materiál:
Zea mays, Helianthus annuus - hydroponicky pěstované, cca 14 dní staré rostliny
Ficus elastica, Beta vulgaris, Pelargonium zonale - listy rostlin dobře saturovaných vodou (plně zalitých)

Vlastní provedení:
Intaktní rostliny:
vážíme rostliny umístěné v nádobkách s živným roztokem, které jsou utěsněny proti vypařování (evaporaci) vody. Hmotnost zjišťujeme v 5 až 10minutových intervalech, porovnáme rychlost transpirace rostlin inkubovaných na světle a ve tmě. Listovou plochu stanovíme planimetricky.
Oddělené listy (Ivanovova metoda): listy uvedených druhů odstřihneme a ihned zvážíme na analytických vahách. Dále vážíme v tříminutových intervalech po dobu jedné hodiny. V průběhu celého experimentu musí být listy dostatečně osvětleny a musí být zabezpečeno dostatečné proudění vzduchu po obou stranách listů (ideální jsou stejné světelné, teplotní i vlhkostní podmínky, za kterých byly rostliny pěstovány). Výsledky vyjádříme ve stejných  jednotkách jako výsledky potometrického stanovení. Listovou plochu stanovíme opět planimetricky.

3. Stanovení počtu průduchů na jednotku listové plochy - mikroreliéfová metoda

Rostlinný materiál:
Zea mays, Helianthus annuus, Ficus elastica, Beta vulgaris, Pelargonium zonale; k práci použijte přednostně ty druhy, u nichž jste stanovovali intenzitu transpirace gravimetricky

Vlastní provedení:

Na povrch listu z obou stran naneseme jemnou vrstvičku bezbarvého laku na nehty a necháme dobře zaschnout. Zaschlou plošku přelepíme bezbarvou izolepou, dobře palcem přitlačíme a pinzetou stáhneme. Otisk přilepíme spolu s izolepou na označené podložní sklo, opět dobře přitlačíme. Počet průduchů stanovíme mikroskopicky, zvlášť na adaxiální a zvlášť na abaxiální straně listů každého rostlinného druhu. Musíme přitom dodržet tyto zásady:

  1. Pro počítání průduchů musíme zvolit správné zvětšení. Počet průduchů v jednom zorném poli má optimálně být v rozpětí 10–40.
  2. Před zahájením stanovení počtu  průduchů si musíme stanovit tzv. počítací rámec. V daném případě je nejjednodušší rozdělit si zorné pole mikroskopu pomyslnou horizontální, středem probíhající linií. Průduchy, které hraničí s okrajem zorného pole mikroskopu (čili nejsou vidět celé) a které se nacházejí nad touto pomyslnou linií do celkového počtu započítáme, pokud jsou pod touto linií, do celkového počtu nezapočítáme.
  3. Počet průduchů pro každý rostlinný druh a každou stranu listu stanovujeme na náhodně vybíraných zorných polích tak, aby suma počtu průduchů byla vyšší než 100. Zaznamenáváme si celkový počet průduchů, počet zorných polí a použitý objektiv mikroskopu (popř. přímo průměr jednoho zorného pole). Průměr zorného pole lze změřit pomocí mikrometrického podložního skla, popř. tuto hodnotu sdělí vyučující.

Výsledky prezentujeme v tabelární formě, počet průduchů vyjádříme v celých číslech  na jednotku listové plochy (cm-2).

Prezentace a diskuse získaných dat

Výsledky potometrického stanovení

  1. Rychlost transpirace [g (H2O).m-2.h-1] vypočtenou zvlášť pro každý jednotlivý časový interval a potometr vyneste do spojnicového grafu oproti časovým intervalům na ose x. Odlište hodnoty naměřené na světle a ve tmě.
  2. Porovnejte mezidruhové rozdíly v rychlosti transpirace.
  3. Porovnejte výsledky pro ozářené rostliny a pro rostliny inkubované ve tmě a odůvodněte naměřené rozdíly!

Výsledky gravimetrických stanovení

  1. Vyneste časový průběh rychlosti transpirace do spojnicového grafu (osa x - časový interval [min], osa y - rychlost transpirace jednotlivých druhů [g (H2O).m-2.h-1]), a to pro obě varianty gravimetrického stanovení
  2. Porovnejte jednotlivé rostlinné druhy z hlediska rychlosti transpirace.
  3. Zjistili jste u některého druhu výskyt Ivanovova skoku?
  4. Zjistili jste u některého druhu nápadný pokles rychlosti transpirace (indikace zavírání průduchů) ve tmě?
  5. Porovnejte navzájem výsledky, které jste naměřili potometrickou technikou a oběma gravimetrickými metodami!

Výsledky mikroreliéfové metody

  1. Porovnejte mezidruhové rozdíly v počtu a lokalizaci průduchů na jednotku listové plochy!
  2. Koreluje celkový počet průduchů na jednotku listové plochy s rychlostmi transpirace zjištěnými (gravimetricky a potometricky) pro jednotlivé rostlinné druhy?