Barvící metody pro pozorování mykorhizní kolonizace kořenů

Přehled nejpoužívanějších metod

Barvení houbových struktur je nerozšířenější a nejdéle použínavou technikou výzkumu mykorhizních asociací.V rámci různých barvicích postupů se stala nejpoužívanější metoda barvení trypanovou modří v laktofenolu (Phillips a Hayman 1970). Při ní jsou v FAA fixované kořeny projasněny roztokem KOH, ev. v případě silně pigmentovaných kořenů vyběleny alkalickým peroxidem vodíku, okyseleny HCl a obarveny 0,05 % trypanovou modří v laktofenolu. Nadbytečné barvivo je odstraněno promytím vzorků v čistém laktofenolu. Houbové struktury jsou po této proceduře zbarveny sytě modře.

Alternativní, procedurálně velmi blízkou metodu vyvinuli Kormanik a McGraw (1982). Oproti předchozí využívá jako barvící médium pro houbové struktury 0,01 %-ní roztok kyselého fuchsinu v laktoglycerolu (= laktoglycerinu). Vypuštění fenolu z barvícího média bylo záměrné kvůli jeho toxickým účinkům a autoři jej doporučují vzhledem ke skutečnosti, že pro většinu rostlinného materiálu bylo barvící médium bez fenolu stejně účinné jako za jeho působení. Jako další klad uvádějí skutečnost, že toto barvící médium lze používat opakovaně (až 7×), zatímco při použití laktofenolu je barvení již při druhém použití jen zřídka efektivní. Roztokem kyselého fuchsinu v laktoglycerolu se barví houbové struktury světle červeně až lehce růžově, nevýhodou zůstává nedostatečná intenzita zbarvení potřebná pro morfologické studie (Rajapakse a Miller 1992).

Hledáním vhodného barviva pro detailní morfologická pozorování interních VAM struktur se zabývali Brundrett a kol. (1984). Porovnáním čtyř druhů barviv, použitých vždy v koncentraci 0,1 % (w/v) v laktoglycerolu zjistili jejich rozdílnou účinnost v barvení mykorhizních struktur Glomus mosseae kolonizujících kořeny Allium porum. Ta se zvyšovala v pořadí kyselý fuchsin < anilinová modř < trypanová modř < chlorazolová čerň E. Barvení posledně jmenovaným barvivem umožňovalo detailní studie morfologie interních VAM struktur, zejména v kombinaci s Nomarského interferenčním kontrastem, kdy bylo možné pozorovat i jemně se větvící hyfy arbuskulů.

Další používanou modifikací původní procedury Phillipse a Haymana (1970) je barvící technika, kterou autoři Koske a Gemma (1989) vyvinuli z důvodu minimalizace rizik vyplývajících z kontaktu s toxickými látkami. V této modifikaci není používán fenol ani kyselina mléčná.

 

Obecné schéma zpracování kořenů v průběhu barvících procedur

Všechny používané barvící techniky mají jedno základní schéma, liší se až v konkrétních postupech zde uvedených jako body 4 až 10.

  1. Opatrné omytí kořenů od částic půdy nebo substrátu pod tekoucí vodovodní vodou.
  2. Fixace a uchovávání vzorků kořenů v FAA (90 ml 50 % etanolu, 5 ml ledové kyseliny octové, 5 ml formaldehydu) nebo jiné fixáži. Fixujeme při pokojové teplotě nejméně 1 den, vzorky je možné ve fixáži uchovávat až po dobu několika let.
  3. Slití fixáže, několikanásobné vyprání fixáže ze vzorků vodovodní vodou.
  4. Projasnění vzorků kořenů v roztoku KOH.
  5. Několikanásobné promytí vzorků vodovodní vodou, pokud z postupu vynecháváme bod 6., poslední promytí destilovanou vodou.
  6. Vybělení silně pigmentovaných vzorků kořenů alkalickým H2O2.
  7. Několikanásobné promytí vodovodní vodou, následně destilovanou vodou.
  8. Okyselení vzorků roztokem HCl.
  9. Vlastní barvení houbových struktur.
  10. Odstranění nadbytečného barviva.

 

Postupy jednotlivých barvících procedur

V následujícím přehledu jsou uvedeny jednotlivé kroky čtyř nejčastěji používaných barvících procedur pro sledování mykorhizní kolonizace kořenů.

Jednotlivé kroky jsou uvedeny vždy v následujícím pořadí pod těmito čísly:

  1. Fixace a uchovávání vzorků kořenů
  2. Projasňování kořenů hydroxidem draselným
  3. Případné vybělováni alkalickým roztokem peroxidu vodíku
  4. Okyselení pomocí roztoku HCl
  5. Barvící médium a procedura
  6. Odstranění nadbytečného barviva

 

 Barvení 0,05% trypanovou modří v laktofenolu (Phillips a Hayman 1970)

  1. FAA
  2. 10% KOH, 15 minut při 120 ºC nebo 1 hodinu při 90 ºC nebo přes noc při laboratorní teplotě
  3. neuvedeno
  4. 1% HCl po dobu 3 minut při laboratorní teplotě
  5. 0,05% (w/v) roztok trypanové modři v laktofenolu (250 ml 80% kyseliny mléčné, 300 g fenolu, 250 ml glycerolu a 300 ml destilované vody), 10 minut při 120  ºC nebo 10 až 15 minut při 90 ºC nebo několik hodin při laboratorní teplotě
  6. čistým laktofenolem

  

0,1% roztoky barviv v laktoglycerolu (Brundrett a kol. 1984)

  1. FAA
  2. 10% KOH, 15 minut při 120 ºC
  3. neuvedeno
  4. neuvedeno(!), musí však být zahrnuto vzhledem k acidofilní povaze všech použitých barviv
  5. 0,1% (w/v) roztoky barviv (chlorazolová čerň E, kyselý fuchsin, anilinová modř, trypanová modř) v laktoglycerolu (stejné objemy 80% kyseliny mléčné, glycerolu a destilované vody), 1 hodinu při 90 ºC
  6. v čistém glycerolu přes noc

 

0,01% kyselý fuchsin v laktoglycerolu (Kormanik a McGraw 1982)

  1. FAA
  2. 10% KOH, 10 minut při 120 ºC nebo 1 hodinu při 90 ºC
  3. alkalický H2O2 (3 ml NH4OH , 30 ml 10% H2O2, 567 ml vodovodní vody; musí být připravován vždy čerstvý), 10 až 20 min nebo podle potřeby
  4. 1% HCl, 3 až 4 minuty při laboratorní teplotě
  5. 0,01% (w/v) kyselý fuchsin v laktoglycerolu (875 ml kyseliny mléčné, 63 ml glycerolu a 63 ml vodovodní vody. V případě, že barvení není účinné, je vhodné použít jako médium laktofenol: 300 g fenolu, 250 ml kyseliny mléčné, 250 ml glycerolu a 300 ml vody), 10 minut při 120 ºC nebo 10 minut až 1 hodinu (případně i více) při 90 ºC
  6. stejné médium jako při barvení, ovšem vždy bez barviva

 

0,05% trypanová modř v acidifikovaném glycerolu (Koske a Gemma 1989)

  1.  50% etanol nebo izopropylalkohol
  2. 2,5% KOH, 3 minuty při 120 ºC
  3. alkalický H2O2 (3 ml 20% NH4OH, 30 ml 3% H2O2; musí být připravován vždy čerstvý), 10 až 45 minut
  4. 1% HCl, 1 hodinu až jeden den
  5. 0,05% trypanová modř v acidifikovaném laktoglycerolu (500 ml glycerolu, 450 ml destilované vody, 50 ml 5% HCl), 3 minuty při 120 ºC nebo 15 až 60 minut při 90 ºC
  6. čistý acidifikovaný glycerol, zahřátí může zvýšit kontrast