Stanovení délky mimokořenového mycelia

Přehled používaných technik

Mykorhizní výzkum od konce 20. století až do současnosti lze charakterizovat vzrůstajícím zájmem o strukturu a funkce mimokořenového mycelia (MKM). Prvním krokem nutným k jeho studiu je přitom jeho extrakce z půdy nebo pěstebního substrátu. Byla vyvinuty tři základní techniky, sloužící k extrakci MKM (jejich přehled a popis udává Dodd 1994): různé varianty techniky membránové filtrace, technika rotujícího drátku a centrifugační technika v roztoku sacharózy. Ze všech těchto technik je nejčastěji používána technika membránové filtrace v celé řadě modifikací. Je nutné zde zdůraznit, že všechny tyto techniky podstatným způsobem narušovaly strukturu MKM, což vylučovalo jejich použití k morfologickým studiím MKM.

První technika schopná extrahovat z půdy či pěstebního substrátu relativně nenarušené MKM mykorhizních hub byla popsána až počátkem 21. století (Baláž a Vosátka 2001). Tato jednoduchá technika byla testována na extrakci MKM čtyř typů mykorhiz, AM, OM, EM a erikoidní mykorhizy. Je současně velmi výhodná pro studium životaschopnosti MKM, neboť malé narušení MKM minimalizuje možnost ztráty enzymatické aktivity.

Technika membránové filtrace

Techniku membránové filtrace (MFT) popsali Hanssen a kol. (1974) a v průběhu doby byla několikrát modifikována. Principem této techniky je, že navážka substrátu je buď rychle míchána nebo mixována s velkým objemem vody. Z této heterogenní směsi je pak odebrán alikvot a ten je přefiltrován přes membránový filtr. Délka hyf na membránovém filtru po jejich obarvení je stanovena některou z metod, nejčastěji průsečíkovou metodou (grid-line intersect). Různé modifikace se liší velikostí navážek, objemem vody, dobou obarvení mycelia, způsobem míchání či mixování či případným použitím ultrazvuku ke snazšímu uvolnění MKM z půdních částic. Z těchto různých modifikací MFT je opět zřejmě nejpoužívanější modifikace Jakobsena a kol. (1992), která se skládá z těchto kroků:

  1. Navážku 5 gramů substrátu mixujeme vysokou rychlostí spolu se 150 ml destilované vody po dobu 30 vteřin.
  2. Tuto suspenzi převedeme do Erlenmayerovy lahve, v níž ji mícháme na magnetické míchačce plnou rychlostí po dobu 60 vteřin.
  3. S pomocí injekční stříkačky odebereme alikvot 20 ml a ten zfiltrujeme přes membránový filtr.
  4. Membránový filtr necháme upnutý v držáku, přelijeme jej 2 ml 0,05% trypanové modři v laktoglycerolu a necháme 5 minut vybarvovat. Poté barvivo odfiltrujeme a několikrát ještě promyjeme destilovanou vodou.
  5. Filtr s nabarvenými hyfami namontujeme jako mikroskopický preparát pro vyhodnocení délky mycelia. Výsledky vztáhneme na použité ředění a navážku substrátu.

Technika vložené membrány

Technika vložené membrány (IMT, inserted membrane technique) využívá faktu, že membránové filtry, vyrobené z esterů celulózy a používané např. v technice membránové filtrace, jsou biologicky inertní a ani v půdě nedochází k jejich degradaci. Celá procedura je velmi jednoduchá: na počátku experimentu vložíme do substrátu tyto membránové filtry, a to buď přímo do oblasti, kde se budou rozvíjet jak kořeny, tak MKM (mykorhizosféra), nebo do hyfového oddělené rhizoboxového systému (hyfosféra). V obou případech však musí být umístění filtrů vzhledem k rostlině radiální, aby filtr samotný nepředstavoval mechanickou překážku šíření hyf. Na konci experimentu filtr opatrně vyjmeme, omyjeme krátkým ponořením do vody od ulpěných částic substrátu a umístíme do Petriho misky, v níž filtr s hyfami obarvíme. Technika vložené membrány má oproti dříve používaným technikám extrakce mycelia tyto základní výhody (viz originální popis IMT v PDF formátu):