Metody vitálního barvení houbových struktur

Přehled používaných metod

V 80. a 90. létech 20. století byly v oblasti výzkumu arbuskulární mykorhizy vyvinuty techniky vitálních barvení, umožňující odlišit živé, enzymaticky aktivní houbové struktury od struktur enzymaticky inaktivních. Takové odlišení je velmi důležité při hledání mechanismů a struktur zúčastněných v látkových přenosech arbuskulárních mykorhiz. Těmito metodami jsou:

• barvení fluresceindiacetátem (FDA), hydrolyzovaným následně houbovými esterázami na volný florescein, detekovaný posléze pomocí fluorescenční mikroskopie (Schubert a kol. 1987)
• barvení iodonitrotetrazoliovou solí (INT), detekující NADH-diaforázovou enzymatickou aktivitu (Sylvia 1988); v aktivních houbových strukturách se vytváří sraženina purpurového formazanu, často ve formě vláken
• barvení nitrobluetetrazoliovou solí (NBT), redukovanou sukcinátdehydrogenázami (tedy enzymem účastnícím se samého metabolického centra každé živé buňky, Krebsova cyklu) v mitochondriích na tmavě modropurpurový formazan (Hamel a kol. 1990)
•  barvení azobarvivy (α-naftylsulfát + Fast Blue R salt), které v místech lokalizace fosfatáz (v závislosti na použitých pufrech lze detekovat jak kyselou, tak alkalickou fosfatázu) tvoří černý precipitát (Tisserant a kol. 1993). Použití tohoto barvení je velmi výhodné z hlediska studia přenosů fosfátových iontů u AM asociací, neboť barvení kvantifikující alkalickou fosfatázu je specifické pro tento typ mykorhizy a je z hlediska přenosu P do rostliny označováno jako marker funkční symbiotické kompatibility AM.

S výjimkou barvení FDA, které nelze využít k barvení vnitrokořenových struktur, lze všechny tyto techniky využít k barvení jak vnitrokořenových, tak mimokořenových houbových struktur. Vhodné jsou ovšem zejména pro sledování životaschopnosti mimokořenového mycelia, neboť zde nedochází k interferencím s enzymatickým aparátem buněk hostitelské rostliny. Opět s výjimkou metody barvení pomocí FDA, po aplikaci metody vitálního barvení je ještě možné zvýraznit enzymaticky neaktivní části mycelia některou barvící metodou používanou pro sledování vnitrokořenových struktur, např. pomocí trypanové modři nebo kyselého fuchsinu.

Barvení INT solí detekující NADH-diaforázu

Tato metoda byla popsána u arbuskulární mykorhizy, je ovšem velmi výhodná i pro jiné typy mykorhiz, např. pro orchideoidní mykorhizu (viz obrázek) nebo pro parazitické houby. V originálním předpisu byla popsána tato barvícího procedura (Sylvia 1988): 

1. Základ barvícího média tvoří TRIS pufr (0,2 M Tris, pH nastavit pomocí HCl na 7,4)
2. V tomto pufru rozpustíme nejprve INT (iodonitrotetrazolovou sodnou sůl) v koncentraci 1 mg/ml barvícího média a posléze redukovanou NADH (v koncentraci 3 mg/ml barvícího média)
3. V tomto médiu barvíme 24 hodin při laboratorní teplotě.

Ve výše citovaném článku však není uvedena řada podstatných detailů, které jsou pro úspěšnou aplikaci této metody podstatné. Jedná se zejména o tato fakta:

1. INT má velmi omezenou rozpustnost v samotném TRIS pufru. Proto je třeba jej nejprve rozpustit v horké směsi metanol/destilovaná voda (1:1, vol/vol). V této směsi činí rozpustnost INT 50 mg/ml směsi.
2. INT i NADH jsou senzitivní na světlo, proto je třeba všechny nádoby s nimi uzavírat do alobalu.
3. Rovněž nádoby (např. Petriho misky), v nichž jsou inkubovány vzorky mykorhizních hub, je třeba chránit před světlem.
4. Chemikálie použité v této metodě jsou poměrně drahé (zejména NADH). Z toho důvodu byla testována možnost použít nižší koncentraci INT a NADH. Snížení těchto koncentrací na 1/3 až 1/5 nevedlo ke snížení intenzity zabarvení houbových struktur.
5. Před aplikací doplňkového barvení (např. trypanovou modří) je nutné promýt vzorek destilovanou vodou a okyselit jej 1%  HCl.
6. Čisté chemikálie (INT i redukovaná NADH) jsou senzitivní na vzdušnou vlhkost a podléhají rovněž oxidaci vzdušným kyslíkem. Proto je třeba je skladovat pod ochrannou argonovou atmosférou a v desikátoru, při teplotě 5 ºC.