CL WEB 

Kontakt     Poslání    Personál    Techniky    Ceníky    Přístroje    Minisklady    Spolupráce    Výuka    Publikace    Archiv    Novinky    Často se ptáte (FAQ)    Diskuse    ABRF

Centrální laboratoř zprostředkovává akademické komunitě přístup k pokročilým technologiím prostřednictvím sdílení finančně náročné instrumentace a její kvalifikované obsluhy. Tím vytváří intelektuální a technickou infrastrukturu nezbytnou k řešení komplexních výzkumných projektů.

Centrální laboratoř je řádným členem Association of Biomolecular Resource Facilities (ABRF), mezinárodní organizace sdružující univerzitní laboratoře typu core facility. Je to v současné době vyspělých technologií jedna z preferovaných cest, jak zajistit na univerzitách odborníkům i studentům přístup k nejnovější instrumentaci a pokročilým metodám. Posláním ABRF je zprostředkovávat komunikaci mezi členy (www stránka, elektronický časopis Journal of Biomolecular Techniques, internetové diskusní fórum), ustavovat specializované sekce, navrhovat a realizovat mechanismy mezinárodního hodnocení práce centrálních laboratoří. Členství v asociaci umožňuje naší laboratoři mj. sladit užívanou metodiku s mezinárodními standardy; v současné době probíhá evaluace syntézy oligonukleotidů NARG 2000-2001.

Výběr optimální sekvence primeru nebo sondy usnadňují počítačové programy, dostupné jednak jako komerční produkty (např. GCG Package, DNAStar Lasergene), jednak volně na Internetu (např.Primer3). V anketě časopisu Biotechnology Software & Internet Journal byl jako nejlepší v kategorii Best Primer Prediction Product vyhodnocen už potřetí v posledních třech letech software OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc.), jehož poslední verze OLIGO 6.44 splňuje nejnáročnější požadavky uživatele.

produkující DNA o požadované délce, hledat vhodný primer kompatibilní s primerem předem striktně daným, analyzovat syntetizovaný primer bez templátu a s templátem, analyzovat PCR primery pro multiplex PCR, navrhovat TaqMan primery a sondy, hledat optimální sekvenační primery a hybridizační sondy, hledat motivy, palindromy a sekundární struktury v zadané sekvenci, možnost vytvářet databáze oligonukleotidů a restrikční mapy, vyhledávat restrikční místa v sekvenci, přidat restrikční místa na 5‘- konec primeru, plánovat místně řízenou mutagenezu, vložit proteinovou sekvenci a na základě reverzní translace vybrat vhodnou sondu, převést koncentraci primeru do zvolených jednotek, aj.

PODROBNĚJI O TECHNIKÁCH

Tyto procesy mohou zahrnovat funkční změny na 5‘- konci cílového oligonukleotidu: fosforylace, zavedení aminoskupiny nebo thioskupiny, vložení můstku, větvení, blokádu a zejména konjugace (digoxigenin, biotin, enzymy, psoralen, akridin, cholesterol, fluorescenční barviva a zhášedla, 2,4-dinitrofenylová skupina, TBR-chelát)

K terapeutickým účelům jsou vhodné modifikace zasahující páteř oligonukleotidu (fosforothioáty, fosforodithioáty, H-fosfonáty, metylfosfonáty), nesoucí rezistenci k nukleázám. Takovouto rezistenci vykazují také oligoribonukleotidy modifikované v 2´ pozici. Komerčně dostupné jsou i modifikace ribózové jednotky.

Zvláštní skupinu modifikací představují peptidonukleové kyseliny (PNA), analoga nukleových kyselin, jejichž páteř tvoří peptid složený z  N-(2-aminoetyl)glycinových podjednotek a jejichž báze svým prostorovým uspořádáním imitují strukturu nukleové kyseliny.

Syntéza DNA, RNA, modifikovaných oligonukleotidů (fluorescein, biotin, degenerace aj.), fosforothioáty, DNA/RNA hybridy, PNA (Peptide Nucleic Acid). Průběh syntézy je monitorován fotometricky. Každý produkt podléhá kontrole kvality (obvykle HPLC). Syntéza DNA probíhá v rozsahu 50 nmol, 200 nmol, 1 m mol nebo 15 m mol. Oligonukleotidy lze obdržet v surovém stavu, odsolené na Sephadexu G-25, purifikované na reverzní fázi (cartridge) nebo purifikované na HPLC koloně.

Špičkový přístroj určený k purifikaci a analýze biomolekul. Umožňuje provádět HPLC i FPLC aplikace na jakékoliv koloně. Optimální je užití perfúzních sorbentů Poros, které dovolují zkrátit dobu separace na jednu desetinu až setinu času nutného při užití klasických sorbentů. BioCAD umožňuje rychlou optimalizaci metody pomocí předprogramovaných templátů (dávkování vzorku, pH, gradient). Objemy dávkovaných vzorků se pohybují od mikrolitrů do litrů. Přístroj dovoluje nasazení až tří kolon. Automatické vytváření gradientu (pH, iontové síly, koncentrace rozpouštědla). Automatický sběrač frakcí, který pracuje v závislosti na čase, objemu nebo změnách prahových hodnot. Detektory: UV/vis (možno zvolit dvě vlnové délky současně), pH elektroda a vodivostní čidlo. Jeden volný vstup na přídavný detektor. Rychlost toku od 0.5 do 60 ml/min. Data, metody a konfigurace automaticky uloženy v paměti.

 Příklady současného využití: purifikace HisTag rekombinantních proteinů, purifikace syntetických oligonukleotidů pro NMR a CD studia, purifikace syntetických therapeutických oligonukleotidů, kontrola kvality syntetických oligonukleotidů

Přístroj pracuje jako optický scanner. Dovoluje detekci biologických makromolekul značených jak radioizotopově, tak fluorescenčně a chemifluorescenčně. Phosphor Screen Autoradiography pracuje s desetinovými expozičními časy ve srovnání s tradiční autoradiografií na filmu. Citlivost desky je 10 - 100x vyšší ve srovnání s filmem. Lineární rozsah 5 řádů. Práce za světla a laboratorní teploty. Fluorescenčně lze detekovat vzorky naznačené fluorochromy excitovatelnými při 450 nm nebo 635 nm. Chemifluorescenční metoda (značení enzymem, který následně provede konverzi substrátu na fluoreskující produkt) poskytuje mnoho výhod ve srovnání s chemiluminiscencí.

Klasicky isotopové značení sondy na membráně s následnou expozicína rtg filmu při –80oC. První vyvolání po 24 hodinách, s následným odhadem expozice řádově ve dnech. Běžně při čerstvém isotopu 3 dny, někdy i týden, při starším isotopu až 10 dní. Na Stormu první expozice minuty, celková expozice řádově hodiny. Velká úsporačasu, zkrácení doby analýzy, větší citlivost, odpadá potřeba temné komory, software umožňuje s obrazem dále pracovat.

Speedvac, pulzní elektroforéza, centrifuga Avanti, UV/vis spektrofotometr, luminiscenční spektrofotometr

• identifikace a charakterizace biopolymerů - dvoudimenzionální elektroforéza, hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF
• bakteriální exprese a purifikace proteinů, např. v rámci přípravy specifických antigenů nebo další molekulární a strukturní charakterizaci

---

Centrální laboratoř
FGP - LMFR
Přírodovědecká fakulta MU
Kotlářská 2
611 37  Brno
Tel.:    05 - 411 29 369
Fax:    05 - 411 29 372
e-mail:    lmfr@sci.muni.cz

---

Obsah webové stránky, připomínky a dotazy: RNDr. Hana Konečná   hanak@sci.muni.cz