Inženýrství a charakterizace luciferáz s vylepšenými bioluminiscenčními vlastnostmi

Project Identification
MUNI/31/05202108/2021
Project Period
7/2021 - 11/2022
Investor / Pogramme / Project type
Masaryk University
MU Faculty or unit
Faculty of Science

Bioluminiscence je proces emise studeného světla s původem v živých organismech, jehož uplatnění v biotechnologických a biomedicínských oborech čím dál více nabývá na důležitosti. Bioluminiscenční reakce jsou například běžně využívány při stanovení biomolekul a iontů, při sekvenování DNA nebo jako klíčová součást zobrazovacích metod pro monitorování genové exprese v rámci jednotlivých buněk a tkání, sledování průběhu infekcí, růstu nádorů a tvorby metastáz a mnohých dalších fyziologických nebo patologických procesů. Jedním z nejvyužívanějších a nejdéle studovaných bioluminiscenčních enzymů je luciferáza z organismu Renilla reniformis (RLuc). Tento enzym in vitro katalyzuje monooxygenaci energeticky bohatého substrátu, koelenterazinu (CTZ), za vzniku dioxethanonového meziproduktu, po jehož následné dekarboxylaci dochází k emisi fotonu viditelného modrého světla. Různé varianty genového reportéru odvozeného od luciferázy RLuc jsou komerčně dostupné, a používají se široce v biomedicínských a biotechnologických laboratořích. Nicméně, hlavní nevýhodou enzymu RLuc je jeho nízká stabilita. Enzym špatně odolává teplotám nad 35 °C a i při skladování při 4 °C dochází nejspíše vlivem agregace k významným koncentračně závislým ztrátám specifické aktivity. K významné inaktivaci enzymu dochází také při jeho kontaktu se substrátem. Jedna molekula RLuc je in vitro schopná katalyzovat přeměnu jen asi 100 molekul koelenterazinu, načež dochází k nevratné ztrátě luciferázové aktivity enzymu; princip tohoto inaktivačního děje není doposud znám. Následkem kombinace vysoké aktivity RLuc se substrátem indukovanou inaktivací tento enzym vytváří bioluminiscenci tzv. zábleskového typu (angl. flash-type), která je charakteristická vysokou intenzitou na počátku reakce následovanou jejím rychlým útlumem. V našem výzkumu jsme se zaměřili na odstranění právě těchto nevýhod RLuc enzymu. Přes rekonstrukci domnělého předka dnešních luciferáz a jeho následného inženýrství jsme byli schopni identifikovat proteinové elementy, které hrají klíčovou roli v evoluci luciferázové reakce. Výsledkem naší práce pak byla konstrukce nových typů syntetických luciferáz, které postrádají nevýhody luciferázy RLuc divokého typu, a krom toho vykazují výrazně zvýšenou afinitu k substrátu (koelenterazin) a generují bioluminiscenci tzv. zářivého typu (angl. glow-type) se stabilním dlouhotrvajícím signálem.

You are running an old browser version. We recommend updating your browser to its latest version.